从植物叶片中提取复合氨基酸
我也是从网上查到的你可以参考一下
1.3 方法
1.3.1 供试样品的制备
采取3个月生植株上的完整健全叶片，在80℃干燥箱中烘干，粉碎，准确称取0.5 g于10 mL安瓿瓶中，加入6 mol/L的HCl 7 mL，充入高纯N2，将安瓿瓶封口，置于105℃恒温干燥箱中消化过夜。冷却后过滤，滤液浓缩近干，加5 mL0.1 mol/L的HCl溶解，取1.5 ml至1.5 ml离心管中，10000转/min离心10 min，取上清液900 ul加入100ul 5nmol/ul内标物SAR，混匀后作为供试样品。
1.3.2 标准溶液的制备
5 nmol/L内标液制备：精密称取SAR 22.3 mg以0.1 mol/L HC1定容至50 mL。
500 pmol/L内标液制备：精密吸取5 nmol/L内标液5 mL以0.1mol/L HC1定容至50 mL。
900 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 1000pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；
225 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 250pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；
90 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 100pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul。
1.3.3 色谱条件
样品自动柱前衍生化程序：吸取硼酸缓冲液5 ul，再吸取OPA试剂1 ul，洗针1次，吸取样品1 ul，原位混合6次。吸取FMOC试剂1 ul，洗针1次，原位混合3次，进样。
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2．1×200 mm
流动相A：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水500 mL溶解，加EDTA溶液50 ul，再加三乙胺90 ul，用1％-2％ 醋酸调pH= 7.20±0.05，再加入四氢呋喃1.5 mL，混合均匀。
流动相B：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水100 mL溶解，用1％一2％ 醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至乙腈200 mL和甲醇200 mL的混合物中，并混合均匀。
柱温：40℃ 紫外检测波长：338 nm；
梯度洗脱：流动相A：以0.45ml/min在0-17min由100%减至40%，17min-18min由40%减少至0；流动相B：以0.45ml/min在0-17min由0增至60%，17min-18min由60%增至100%，18.1min-23.9min流速由0.45ml/min-0.80ml/min，运行至24min结束。
1.3.4 测定方法和数据处理
分别精密量取对照品溶液和供试样品各1 ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至脯氨酸峰出峰后即得。以3种浓度的标样制作校正表，按Agilent公司提供的氨基酸分析软件包进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 紫苏属植物叶片中氨基酸组成及含量比较
27份材料叶片中均测得17种氨基酸，其氨基酸种类较齐全。所测氨基酸中以甘氨酸平均含量最高，达6.68mg/g，其次是亮氨酸和谷氨酸，分别为4.77mg/g和4.59mg/g。与人体健康关系最为密切的赖氨酸平均含量有1.87mg/g。7种必需氨基酸总量平均为14.58mg/g，占氨基酸总量的比例为32.43%。
氨基酸总量超过50 mg/g的材料共有6份（P06-11紫、P06-6、P06-7、P06-12紫、P06-15紫、P06-13），其中材料P06-7氨基酸总量最高，达57.65mg/g ，较总含量最低的材料P06-33多23.07 mg/g。17种氨基酸中有9种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸）含量均以P06-7最高，而有6种氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）含量的最低值出现在P06-33中。必需氨基酸含量变化范围在11.10 -19.55 mg/g之间，仍以P06-7为最高。非必需氨基酸含量的变化趋势与氨基酸总量的变化趋势大致相同。
各氨基酸在材料间的变异较大。变异系数最大的是脯氨酸，达59.19%，其次是组氨酸和赖氨酸，分别为29.91%和25.63%。异亮氨酸的变异系数最小，为11.34%，其它氨基酸的变异系数均在10%-20%之间。氨基酸总量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量的变异系数在10%-15%之间。先用蛋白酶和肽酶处理得到氨基酸，然后用有机溶剂萃取，再进行分馏。
一，植物中游离氨基酸的提取；
1，烘干材料中游离氨基酸的提取:
从植物的叶片、叶脉及种子中提取游离氨基酸一般先需要干燥处理,叶片、叶脉要在105~110摄氏度杀青,然后60~80摄氏度烘干、粉碎,过40目筛。一些研究者用75%或80%的酒精作溶剂从粉碎原料中提取氨基酸,也有用蒸馏水作萃取溶剂提取,提取的方法是常温或加热到一定温度(小于100摄氏度)用一定体积分数的萃取溶剂浸泡2~6h,或加热回流20~30min,为了使原料中的游离氨基酸尽可能得以溶解,提取过程需重复2~3次,然后合并提取液、过滤,蒸发掉乙醇,既得到了氨基酸粗提液。也有人采用蒸馏水作溶剂超声波提取提取的方法,或在室温下样品用50%乙醇浸泡微波萃取,然后离心过滤,若用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的含量,常用2%~5%的磺基水杨酸水溶液浸提。
2，鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取：
鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取鲜叶片或鲜果肉一般用10%ch3cooh研磨或匀浆来进行提取,但由于鲜叶片或鲜果肉中的蛋白酶能水解蛋白质,造成游离氨基酸含量升高,故研磨要在冰浴中进行,新鲜材料中的脂、蛋白质、糖等易被提出,需加入一定的试剂除去。通常用10%三氯乙酸、一定浓度的醋酸铅、磺基水杨酸或95%乙醇加入过夜沉淀,然后离心或过滤的方法除去蛋白质,用乙酸乙酯或乙醚萃取以除去脂类等。
二，游离氨基酸的纯化；
从植物中提取的氨基酸粗提液中含有较多的色素、可溶性糖、有机酸及其他杂质,有必要对氨基酸粗提液进一步进行纯化,以便下一步进行氨基酸含量的测定。
最常用的纯化方法是用732阳离子交换树脂进行纯化。
732阳离子交换树脂在使用前要进行预处理,用一定浓度的盐酸浸泡树脂24h以上,然后用蒸馏水漂洗至中性,为的是除去树脂中的杂质,并使其完全转化成氢型阳离子交换树脂,湿法装柱,注意树脂间不能存有气泡,把氨基酸粗提液经适当浓缩到小体积后,倒入树脂柱中,让其缓慢流入树脂层,当氨基酸植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法粗提液全部进入树脂后,停留10min,以便使氨基酸充分结合到树脂上,接着用一定量的蒸馏水冲洗树脂,以吸取色素、水溶性糖等杂质,当流出液变清后,用0.5~4mol/l的氨水进行洗脱,收集洗脱液至用茚三酮检测无色为止。把洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干。用0.1mol/l盐酸溶解并定容之一定体积即可。该方法氨基酸损失,纯化效果好,故最常用于植物中提取的游离氨基酸的纯化。
也有研究者用活性炭进行纯化,把具有较强吸附能力的活性炭直接加入到氨基酸粗提液中,加热一段时间,然后过滤,以除去色素等,但活性炭对部分氨基酸也能吸附,造成氨基酸的损失
从植物叶片中提取复合氨基酸
我也是从网上查到的你可以参考一下
1.3 方法
1.3.1 供试样品的制备
采取3个月生植株上的完整健全叶片，在80℃干燥箱中烘干，粉碎，准确称取0.5 g于10 mL安瓿瓶中，加入6 mol/L的HCl 7 mL，充入高纯N2，将安瓿瓶封口，置于105℃恒温干燥箱中消化过夜。冷却后过滤，滤液浓缩近干，加5 mL0.1 mol/L的HCl溶解，取1.5 ml至1.5 ml离心管中，10000转/min离心10 min，取上清液900 ul加入100ul 5nmol/ul内标物SAR，混匀后作为供试样品。
1.3.2 标准溶液的制备
5 nmol/L内标液制备：精密称取SAR 22.3 mg以0.1 mol/L HC1定容至50 mL。
500 pmol/L内标液制备：精密吸取5 nmol/L内标液5 mL以0.1mol/L HC1定容至50 mL。
900 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 1000pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；
225 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 250pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；
90 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 100pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul。
1.3.3 色谱条件
样品自动柱前衍生化程序：吸取硼酸缓冲液5 ul，再吸取OPA试剂1 ul，洗针1次，吸取样品1 ul，原位混合6次。吸取FMOC试剂1 ul，洗针1次，原位混合3次，进样。
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2．1×200 mm
流动相A：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水500 mL溶解，加EDTA溶液50 ul，再加三乙胺90 ul，用1％-2％ 醋酸调pH= 7.20±0.05，再加入四氢呋喃1.5 mL，混合均匀。
流动相B：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水100 mL溶解，用1％一2％ 醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至乙腈200 mL和甲醇200 mL的混合物中，并混合均匀。
柱温：40℃ 紫外检测波长：338 nm；
梯度洗脱：流动相A：以0.45ml/min在0-17min由100%减至40%，17min-18min由40%减少至0；流动相B：以0.45ml/min在0-17min由0增至60%，17min-18min由60%增至100%，18.1min-23.9min流速由0.45ml/min-0.80ml/min，运行至24min结束。
1.3.4 测定方法和数据处理
分别精密量取对照品溶液和供试样品各1 ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至脯氨酸峰出峰后即得。以3种浓度的标样制作校正表，按Agilent公司提供的氨基酸分析软件包进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 紫苏属植物叶片中氨基酸组成及含量比较
27份材料叶片中均测得17种氨基酸，其氨基酸种类较齐全。所测氨基酸中以甘氨酸平均含量最高，达6.68mg/g，其次是亮氨酸和谷氨酸，分别为4.77mg/g和4.59mg/g。与人体健康关系最为密切的赖氨酸平均含量有1.87mg/g。7种必需氨基酸总量平均为14.58mg/g，占氨基酸总量的比例为32.43%。
氨基酸总量超过50 mg/g的材料共有6份（P06-11紫、P06-6、P06-7、P06-12紫、P06-15紫、P06-13），其中材料P06-7氨基酸总量最高，达57.65mg/g ，较总含量最低的材料P06-33多23.07 mg/g。17种氨基酸中有9种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸）含量均以P06-7最高，而有6种氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）含量的最低值出现在P06-33中。必需氨基酸含量变化范围在11.10 -19.55 mg/g之间，仍以P06-7为最高。非必需氨基酸含量的变化趋势与氨基酸总量的变化趋势大致相同。
各氨基酸在材料间的变异较大。变异系数最大的是脯氨酸，达59.19%，其次是组氨酸和赖氨酸，分别为29.91%和25.63%。异亮氨酸的变异系数最小，为11.34%，其它氨基酸的变异系数均在10%-20%之间。氨基酸总量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量的变异系数在10%-15%之间。先用蛋白酶和肽酶处理得到氨基酸，然后用有机溶剂萃取，再进行分馏。
一，植物中游离氨基酸的提取；
1，烘干材料中游离氨基酸的提取:
从植物的叶片、叶脉及种子中提取游离氨基酸一般先需要干燥处理,叶片、叶脉要在105~110摄氏度杀青,然后60~80摄氏度烘干、粉碎,过40目筛。一些研究者用75%或80%的酒精作溶剂从粉碎原料中提取氨基酸,也有用蒸馏水作萃取溶剂提取,提取的方法是常温或加热到一定温度(小于100摄氏度)用一定体积分数的萃取溶剂浸泡2~6h,或加热回流20~30min,为了使原料中的游离氨基酸尽可能得以溶解,提取过程需重复2~3次,然后合并提取液、过滤,蒸发掉乙醇,既得到了氨基酸粗提液。也有人采用蒸馏水作溶剂超声波提取提取的方法,或在室温下样品用50%乙醇浸泡微波萃取,然后离心过滤,若用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的含量,常用2%~5%的磺基水杨酸水溶液浸提。
2，鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取：
鲜叶片或鲜果肉中游离氨基酸的提取鲜叶片或鲜果肉一般用10%ch3cooh研磨或匀浆来进行提取,但由于鲜叶片或鲜果肉中的蛋白酶能水解蛋白质,造成游离氨基酸含量升高,故研磨要在冰浴中进行,新鲜材料中的脂、蛋白质、糖等易被提出,需加入一定的试剂除去。通常用10%三氯乙酸、一定浓度的醋酸铅、磺基水杨酸或95%乙醇加入过夜沉淀,然后离心或过滤的方法除去蛋白质,用乙酸乙酯或乙醚萃取以除去脂类等。
二，游离氨基酸的纯化；
从植物中提取的氨基酸粗提液中含有较多的色素、可溶性糖、有机酸及其他杂质,有必要对氨基酸粗提液进一步进行纯化,以便下一步进行氨基酸含量的测定。
最常用的纯化方法是用732阳离子交换树脂进行纯化。
732阳离子交换树脂在使用前要进行预处理,用一定浓度的盐酸浸泡树脂24h以上,然后用蒸馏水漂洗至中性,为的是除去树脂中的杂质,并使其完全转化成氢型阳离子交换树脂,湿法装柱,注意树脂间不能存有气泡,把氨基酸粗提液经适当浓缩到小体积后,倒入树脂柱中,让其缓慢流入树脂层,当氨基酸植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法粗提液全部进入树脂后,停留10min,以便使氨基酸充分结合到树脂上,接着用一定量的蒸馏水冲洗树脂,以吸取色素、水溶性糖等杂质,当流出液变清后,用0.5~4mol/l的氨水进行洗脱,收集洗脱液至用茚三酮检测无色为止。把洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干。用0.1mol/l盐酸溶解并定容之一定体积即可。该方法氨基酸损失,纯化效果好,故最常用于植物中提取的游离氨基酸的纯化。
也有研究者用活性炭进行纯化,把具有较强吸附能力的活性炭直接加入到氨基酸粗提液中,加热一段时间,然后过滤,以除去色素等,但活性炭对部分氨基酸也能吸附,造成氨基酸的损失
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